當(dāng)前最常用來進(jìn)行PET的降解與循環(huán)再利用的方法需要加入有毒試劑，這不僅會造成二次污染，而且降解產(chǎn)物很難循環(huán)再利用。因此發(fā)展綠色溫和的PET水解酶，并回收水解產(chǎn)物用于PET再生，一直是科研人員的目標(biāo)之一。

在眾多塑料制品中，生產(chǎn)和使用最多的是聚對苯二甲酸乙二酯(PET)塑料，然而對于PET的降解和循環(huán)利用卻是一個國際難題。近日湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室郭瑞庭教授和陳純琪教授團(tuán)隊在前期工作基礎(chǔ)之上，對PET水解酶機(jī)制進(jìn)行了解析及性能提升改造，使之具有高效水解功能。該研究成果2月15日以封面文章發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊《美國化學(xué)學(xué)會-催化》上。

解析結(jié)構(gòu)，助力PET水解酶改造

塑料制品的出現(xiàn)給人類的生活帶來了很大的便利，人們在享受這一便利的同時，也承受著塑料污染對自然環(huán)境和人類健康的巨大負(fù)面影響，全世界都在想盡辦法解決塑料污染問題。

在所有塑料制品中，PET塑料使用量巨大，當(dāng)前最常用來進(jìn)行PET的降解與循環(huán)再利用的方法需要加入有毒試劑，這不僅會造成二次污染，而且降解產(chǎn)物很難循環(huán)再利用。

發(fā)展綠色溫和的PET水解酶，并回收水解產(chǎn)物用于PET再生，一直是科研人員的目標(biāo)之一。

“要使PET達(dá)到最好的降解效果，需要水解酶能夠在PET玻璃態(tài)的溫度范圍內(nèi)(65℃—70℃)或高于這個溫度下進(jìn)行反應(yīng)。”陳純琪表示，如果能提高PET水解酶的耐熱性，一些PET塑料就能通過用酶清洗實(shí)現(xiàn)回收利用，就像含酶的洗滌劑可以分解臟衣服上的食物污漬一樣。

陳純琪注意到日本研究團(tuán)隊曾公布了一個耐熱角質(zhì)酶ICCG，它的最適反應(yīng)溫度達(dá)到了65 ℃，是已知PET水解酶中活力最高的。“ICCG為何不同于其他PET水解酶，水解活力和耐熱性都異常突出呢?如果能了解ICCG獨(dú)特的作用機(jī)制，我們也有可能從中得到啟發(fā)，獲得更具熱穩(wěn)定性的PET水解酶。”陳純琪說。

郭瑞庭、陳純琪一直深耕于PET水解酶領(lǐng)域，2017年團(tuán)隊在國際上首次解析了PET水解酶IsPETase的晶體結(jié)構(gòu)，隨后在2021年又首次發(fā)現(xiàn)了影響IsPETase水解PET的關(guān)鍵二元體。

“我們充分運(yùn)用了團(tuán)隊在結(jié)構(gòu)生物學(xué)和理性設(shè)計及改造方面的研究專長，使用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段解析了ICCG的失活突變體(S165A)與底物MHET的復(fù)合體結(jié)構(gòu)。”郭瑞庭解釋道，結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，MHET結(jié)合在酶表面的活性凹槽內(nèi)，4個突變體中的2個位于MHET的結(jié)合位點(diǎn)附近，其中G127位于酶的表面，與MHET結(jié)合的活性凹槽鄰近，I243的存在擴(kuò)大了底物結(jié)合通道，這可能增加了PET的結(jié)合能力，這個特征也揭示了I234突變體可能具有更高的PET水解活性。”

內(nèi)外兼顧，實(shí)現(xiàn)PET高效水解

“有了復(fù)合體結(jié)構(gòu)作為基礎(chǔ)，我們接下來的ICCG耐熱性改造就可以做到有的放矢。”陳純琪解釋說，“為了增加耐熱性，我們采取內(nèi)外兼顧的策略改造ICCG，即增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水相互作用和增加蛋白質(zhì)表面脯氨酸的親水相互作用。我們共選擇并構(gòu)建了27個突變體，其中有7個突變體在90℃時比ICCG具有更高的活性。”

團(tuán)隊進(jìn)一步將這7個突變體組合突變，篩選獲得5個活性明顯提升的三突變體。最后，優(yōu)中選優(yōu)，得到3種活性更高且變性溫度比ICCG高出3℃的突變體(RIP、KIP和KRP)。

為了進(jìn)一步探索突變體熱穩(wěn)定性增加的分子機(jī)制，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段被再次運(yùn)用。結(jié)果顯示，突變分別在酶的外殼、中層、核心產(chǎn)生了穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的效果，“我們猜測是這些個別效應(yīng)疊加起來增進(jìn)了蛋白質(zhì)整體的耐熱性。”陳純琪說。

本研究成果的獲得，更加清晰地闡述了PET水解酶的分子機(jī)制，同時也證明了增加耐熱性對PET生物降解的重要性。為發(fā)展閉環(huán)式循環(huán)PET生物降解平臺提供了一個新的思路。

關(guān)鍵詞： 水解酶改造 解析結(jié)構(gòu) 水解產(chǎn)物